蛋白質(zhì)濃度測(cè)定是用于計(jì)算純化方法的回收率的重要方法。常用的測(cè)定方法包括雙縮脲法、Lowry法、紫外吸收法、BCA蛋白濃度檢測(cè)法等。其中常用的方法就是BCA法。BCA 全稱是Bicinchoninic Acid Assay, 也叫Smith Assay,這個(gè)方法是由Paul K. Smith 發(fā)明的。這個(gè)方法通過展示不同濃度樣品的顏色變化來判斷蛋白的濃度。
檢測(cè)原理
BCA是一種堿性的水溶性復(fù)合物,性質(zhì)穩(wěn)定。在其提供的堿性環(huán)境下,蛋白質(zhì)可以將BCA試劑中的Cu2+還原為Cu+,Cu+繼而與BCA試劑螯合,從而產(chǎn)生藍(lán)紫色的絡(luò)合物,在562nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)吸收峰,通過測(cè)定吸光度,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得知蛋白濃度。BCA法因抗干擾性強(qiáng)、簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,靈敏度高而得到廣泛應(yīng)用,但其也易受溫度、孵育時(shí)間的影響。
實(shí)驗(yàn)步驟
一、配制標(biāo)準(zhǔn)品和工作液
1. 配制 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品體系(線性范圍 20-2000 μg/mL 或者 5-250μg /mL 標(biāo)準(zhǔn)品制備各 2 種配置方法,請(qǐng)根據(jù)習(xí)慣選用恰當(dāng)方式)?!咀ⅰ浚築SA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 2 mg/mL,稀釋液為蛋白樣品的溶解液,原則上蛋
白樣品在什么溶液中,標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但也可用水或 1 X PBS 進(jìn)行稀釋。BSA 標(biāo)準(zhǔn)品體系配制表(配制后可放置于 4℃ 冰箱多次使用)
2. 配制 BCA 工作液
① 計(jì)算所需要的總 BCA 工作液體積???BCA 工作液體積=(標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量+待測(cè)樣品數(shù)量)x 重復(fù)數(shù) x 每個(gè)
樣品所需要的 BCA 工作液?!咀ⅰ浚涸嚬芊z測(cè)時(shí)每個(gè)樣品加 2.0 mL BCA 工作液,微孔板檢測(cè)每個(gè)
樣品加 200 μL BCA 工作液。
② 配制 BCA 工作液:50 體積的 BCA 試劑 A 中加入 1 體積的 BCA 試劑 B(A:B=50:1),充分混勻?!咀ⅰ浚築CA 工作液裝入密封容器內(nèi),室溫條件 24h 穩(wěn)定。
二、檢測(cè)方法
1. 試管檢測(cè)方法(樣品:BCA工作液=1:20)
2.微孔板檢測(cè)方法(樣品: BCA 工作液=1:20)
① 各取 10 μL 標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到微孔板中。【注】:樣品與工作液比例為 1:20,檢測(cè)范圍為 125-2000μg/mL。若樣品濃度非常低,可使用 25μL 標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)(即 1:8),這時(shí)試劑盒的檢
測(cè)范圍為 20-2000 μg/mL。
② 每孔加入 200 μL BCA 工作液,槍頭吹打充分混勻。蓋上微孔板,37℃ 孵育 30 min。
③ 冷卻到室溫,在酶標(biāo)儀上的 562 nm 波長(zhǎng)范圍處檢測(cè)吸光度。
④ 根據(jù) BSA 標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度(減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的 OD 值即最終的讀數(shù)),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線( X-蛋白濃
度μg/mL;Y-最終的 OD 562nm)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度。
注意事項(xiàng)
在進(jìn)行BCA法檢測(cè)蛋白濃度的實(shí)驗(yàn)過程中,精確性和可靠性是至關(guān)重要的。以下是一些關(guān)鍵的操作要點(diǎn)和在實(shí)驗(yàn)過程中可能遇到的常見問題及其解決策略:
? 試劑的準(zhǔn)備和存儲(chǔ):確保所有試劑在使用前充分混合且在推薦的溫度下存儲(chǔ)。試劑的新鮮度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響,過期或不當(dāng)存儲(chǔ)的試劑可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。
? 操作順序的嚴(yán)格遵守:在進(jìn)行BCA實(shí)驗(yàn)時(shí),嚴(yán)格按照試劑添加順序和操作步驟進(jìn)行,避免任何步驟的顛倒或省略。這些步驟設(shè)計(jì)的順序是為了提高反應(yīng)效率和結(jié)果的一致性。
電話
微信咨詢
關(guān)注公眾號(hào)